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但是那么大的膜孵育体 积一般最少为3-5ml
浏览: 发布日期:2018-12-28

  32、要做磷酸化某因子 Western Blot,其二抗有何要求? 答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用 HRP 标记的二抗。

  答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小 分子的就透过去了。

  答:可以选择 0.2μml 的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。 其他按步骤即可。

  23、蛋白变性后可以存放多久?答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化

  2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白?

  14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和 western blot 试验吗? 做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

  30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

  10、DAB 好还是 ECM 好?

  12、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?

  答:200kd 的蛋白不好做, 分离胶用7%,积层胶 3.5%。

  答: a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高 SDS 浓度,同时将样 品煮沸时间延长, b) 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。

  答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应 得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶 55v,分离胶 75v 就能跑得很好。2、胶的

  49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的 TBST 脱脂奶粉”,其中TBST 最后那个

  答:你的一抗浓度较高,二抗上 HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临 界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。

  22、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?

  样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超载.

  用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中 的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。

  答:a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是 否有改善.;b) 显影时间过长。

  39、如果是 6×8 转印膜,要加多少一抗? 答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体

  50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在 4 度

  答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文 献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。

  16、细胞水平要做western blot,多少细胞提的蛋白够做 western blot?

  制磷酸化酶的活性。

  53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

  性

  24、我所测定的蛋白分子量是 105KD,按理说分离胶应当采用 7.5%,但资料却要求 分离胶和浓缩胶均采用 11%的配方,不知为何?

  答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加

  5、我的目的带很弱,怎么加强?答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

  40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次

  a) 二抗的 HRP 活性太强,将底物消耗光;b) ECM 底物中H2O2,不稳定,失活;c) ECL 底物没覆盖到相应位置;d) 二抗失活。

  20%甲醇。

  在网上查查就可以选出你要的内参。

  答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的 WesternBlot 则上

  36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?答:可以。

  9、我在显影液中显影1 分钟和 5 分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

  4、我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?

  b)蛋白本身的修饰如:糖基化,磷酸化等

  51、请问一下 PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几

  答:做 200kd 蛋白的Western Blot 时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小 心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

  答: 原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 你的细胞中的蛋 白质被降解掉了,你必需加入 PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗体不能识别目标蛋白, 多看看说明,看是否有问题。

  答:一般 5×10^6 就足够了

  17、同一样品能同时提 RNA 又提蛋白么?这样对 western blot 有无影响? 答:能,没有问题。

  答:a)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b)用 5倍的上样缓冲液来稀释变

  二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结 果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合 Western Blot 的 怎样做也不行。

  答:上述提到的两种凝胶均可以使用,因为 105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨 范围内,但需注意条带位置。

  答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd 和 66kd 可以一起转,12%SDS- PAGE, 湿转 120mA, 45-60min 就可以了,可以根据你实验室的经验调节;170kd 用

  洗脱效率,但可增加蛋白质和 NC 膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度 0.1%SDS,也是为了增加转移效率; 用优质的转移膜,或使用小孔径的 NC 膜(0.2 微米).

  46、核内抗原 WesternBlot 内参选择什么合适? 答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,

  34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗? 答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用 2-

  31、一抗,二抗的比例是否重要?答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。

  4 度过夜。

  答:可以考虑:转移缓冲液中加入 20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质

  19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上 NaF 去抑

  28、问大分子量蛋白200KD,在做 western要注意什么呢?

  答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是 HRP 最敏感的底物;ECM 结果容易控制,但被 催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测 pg 级抗原。要看你实验 的情况。

  13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加 NaF 等?

  7、目标带是空白,周围有背景,是为什么?

  47、做半定量 WesternBlot,内参 β-actin,GAPDH 哪个好? 答:选用 beta-actin就可以。

  下?

  48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响? 胞膜和胞浆有区别吗?

  18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗? 答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

  积一般最少为3-5ml。

  3 次。稀释后应在 2-3 天内使用,4 度保存,避免反复冻融。

  15、做 Western Blot 时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到 120μg,换了个 santa cloz 的一抗仍 不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF 行吗?

  答:可能是:a)样品浓度过低;b)转移时间不够,。

  52、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压 有什么要求?

  20、我的样品的蛋白含量很低,每微升不到 1 微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡 了,有什么办法可以解决?

  44、我用的是可视 marker,但是电泳总跑不全 8 条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过 8%,10%,12%,都是这样。marker 是新买的。

  掉(也是被酶水解了)。

  11、抗原检测出的分子量比资料上的大,是怎么回事?答:a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。

  答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后

  29、有什么方法可以提高上样量?

  8、我的胶片是一片空白,是怎么回事?答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

  答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。 同时,建议检查 Western Blot 过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加 PMSF 就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

  答: 灵敏,可达 ng 级,用 Ecl 显色法理论上可达 pg 级。方便,特异性高。

  42、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小 21KD,中至 66KD,大至 170KD,可以 一次做好吗?

  ② 两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,游戏代理,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

  41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点

  答:是Tween,配方如下:Tris-BufferedSaline Tween-20 (TBST), NaCl:8g, Tris base:2.42g 加水 800ml 溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用 HCl 调节 pH 至 7.4, 加水 定容至1L.

  6、胶片背景很脏,有什么解决方法?答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。

  35、在做 Western Blot 时,PVDF 膜用甲醇浸泡的目的?

  答: ① 免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不 易与背景区分;Western blot 可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

  答:一般来说,是小分子量 Marker 跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

  答:PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团,使它更容易跟带 负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

  T 是 Tween吗,浓度多大?

  37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为 什么?

  的缓冲液

  答:NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。

  答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。

  答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是 线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是 蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

  25、二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封 闭液是否要作调整,能否再用 5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?

  43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?

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